twitter

image1 image1 image1 image1

Walidacja metody oznaczania malonodialdehydu – markera stresu oksydacyjnego w paszach

Katarzyna Kos1), Aneta Woźniak1), Dorota Krasucka1), Ewa Łysiak1), Wojciech Cybulski2)

Państwowy Instytut Weterynaryjny – Państwowy Instytut Badawczy

1)Zakład Farmacji Weterynaryjnej, 2)Zakład Farmakologii i Toksykologii,  Al. Partyzantów 57, 24-100 Puławy

Streszczenie. Wolne rodniki generują procesy peroksydacji nienasyconych kwasów tłuszczowych. Jednym z finalnych produktów oksydatywnego utleniania lipidów jest malonodialdehyd (MDA). MDA występuje w organizmie w dwóch postaciach: endogennej – powstaje na skutek peroksydacji lipidów w tkankach, lub egzogennej – generowany w wyniku pobierania aldehydu dimalonowego m.in wraz z pokarmem. Badania dowodzą, że spożywanie pokarmu zawierającego egzogenny malonodialdehyd ma wpływ na poziom MDA w organizmie.

MDA wykazuje działanie cytotoksyczne, genotoksyczne, mutagenne oraz kancerogenne. Jest zarówno markerem stresu oksydacyjnego, wieku biologicznego, jak i ryzyka nowotworowego.  Malonodialdehyd generuje syntezę barwników lipofuscynowych, wpływa na zjawisko cross-linking w białkach które uszkadza,  powoduje również degradację jądra komórek, oraz hamuje podziały mitotyczne. Aldehyd ten może również prowadzić do zahamowania syntezy kwasu dezoksyrybonukleinowego, rybonukleinowego oraz łańcuchów polipeptydowych. Informacje na temat wpływu malonodialdehydu na organizm zwierząt rodzą pytania dotyczące skutków spożywania pasz z domieszką MDA.

Celem prac badawczych było opracowanie metody oznaczania malonodialdehydu jako markera  stresu oksydacyjnego w paszach. Pasza została przygotowana poprzez zmieszanie odpowiednio przygotowanego rozcieńczenia wzorca malonodialdehydu z odważką paszy 5 ± 0,05 g. Badania obejmowały walidację metody oznaczania MDA przy użyciu chromatografu gazowego Varian CP-3800 z detektorem FID i kolumną chromatograficzną RESTEK Rtx-1 30 m x 0,25mm; 0,25 µm. Zoptymalizowano następujące parametry metody: przepływ gazu nośnego (He): 1,2 ml/min, przepływ N2, H2, powietrza syntetycznego: 25, 30, 300 ml/min, temperatura dozownika: 200C, temperatura detektora: 330C, objętość dozowania: 1 µl, czas analizy: 17  min.

Zwalidowano następujące parametry metody: liniowość wskazań detektora, liniowość oznaczeń MDA w paszy, powtarzalność metody, a także określono odzysk. Krzywą kalibracyjną przygotowano na 4 poziomach stężeń w 3 powtórzeniach, co odpowiada następującym poziomom stężeń: 1,168; 5,84; 11,68; 23,36 µg/g paszy. Czas retencji oznaczonego MDA wynosił 9,37 min. Metoda charakteryzuje się bardzo dobrą powtarzalnością (CV < 7 %).

 

Validating the method of determining malondialdehyde, a marker  of oxidative stress in animal feeds

Katarzyna Kos1), Aneta Woźniak1), Dorota Krasucka1), Ewa Łysiak1), Wojciech Cybulski2)

National Veterinary Research Institute-State Research Institute, 1)Department of Veterinary Pharmacy,

2)Department of Pharmacology and Toxicology, Al. Partyzantów 57, 24-100 Pulawy

Summary. Free radicals generate unsaturated fatty acids within peroxidation processes. One of the end product of lipid oxidation is malonodialdehyde (MDA).  MDA is present in two forms in the body: endogenous - occurs as a result of lipid peroxidation in the tissues, or exogenous - available for example from food/feed. Research showed that consumption of products containing exogenous malonodialdehyde affects MDA levels in the body. MDA is cytotoxic, genotoxic, mutagenic, and carcinogenic. It is both a marker of oxidative stress, biological age and the risk of cancer.

Malonodialdehyde stems for lipofuscin synthesis, affects cross-linking of proteins that are damaged. It is also a cause of cell nucleus degradation and inhibition of mitotic divisions. The aldehyde may also lead to synthesis of deoxyribonucleic and ribonucleic acids inhibition, and polypeptide chains formation. Impact of those processes in animals implies question on malondialdehyde presence in the feedingstuffs.

The aim of the research was to develop a method of determining malondialdehyde as a marker of oxidative stress in the feed. Feed samples were prepared by mixing 5 ± 0.05 g of feed with malondialdehyde. Experiments included validation study followed MDA determination  in gas chromatograph, Varian CP-3800 with FID detector and chromatography column Restek Rtx-1 30 mx 0.25 mm; 0.25 m. Optimized GC method parameters were set up: carrier gas flow (He), 1.2 ml / min, N2, H2 flow; synthetic air,  25, 30, 300 ml / min; injector temperature, 200 ° C; detector temperature, 330° C; dispensing volume: 1 µl; analysis time, 17 min.

Validation parameters of MDA determination were established: the linearity of the detector, linear determination of MDA concentrations in feed, reproducibility of the method and a recovery. A calibration curve was prepared at four concentration levels of MDA in 3 replications: 1.168, 5.84, 11.68, 23.36 mg/g of feed. The retention time of  designated MDA was 9.37 min. The method is characterized by a very good reproducibility (CV less than 7%).