twitter

image1 image1 image1 image1

Występowanie C. botulinum w paszach dla bydła

C. botulinum occurrence in cattle feeds

Tomasz Grenda, Elżbieta Kukier, Magdalena Goldsztejn, Krzysztof Kwiatek

Zakład Higieny Pasz,

Państwowy Instytut Weterynaryjny - Państwowy Instytut Badawczy

Bakterie z gatunku C. botulinum stanowią beztlenowe laseczki przetrwalnikujące, zdolne do produkcji najsilniejszych toksyn biologicznych naturalnie występujących w przyrodzie. Rozróżnianych jest osiem typów toksycznych tego patogenu oznaczonych kolejnymi literami alfabetu od A do H (1).  Toksyny botulinowe są czynnikiem etiologicznym schorzenia określanego jako botulizm. Za najczęściej powodujące wspomniane schorzenie u zwierząt uznawane są toksyny produkowane przez C. botulinum C i D. Objawy  sąwywoływane poprzez oddziaływanie aktywnych form toksyn botulinowych (BoNT), które posiadają budowę cynkozależnych endoproteinaz, na kompleks białek błony presynaptycznej neuronów (SNARE). Wskutek degradacji jednego z białek SNARE dochodzi do zahamowania mechanizmu uwalniania acetylocholiny, co prowadzi do zaburzeń przewodzenia impulsów nerwowych. Botulizm u bydła w zależności od ilości wchłoniętej toksyny przyjmuje przebieg ostry, podostry lub przewlekły. Schorzenie manifestuje się porażeniem wiotkim mięśni szkieletowych. Śmierć zwierzęcia następuje najczęściej wskutek zaburzenia pracy przepony i niewydolności oddechowej. Częstą przyczyną rozwoju schorzenia u bydła jest podawanie zwierzętom niewłaściwie sporządzonych kiszonek. Źródłem C. botulinum w kiszonkach może być gleba (bogata w materięorganiczną, z terenów zalewowych, podmokłych), szczątki padłych zwierząt czy pomiot kurzy. Podejrzewa się również, że nawożenie upraw przeznaczonych na kiszonki pozostałościami fermentacyjnymi z biogazowni może być pierwotną przyczyną botulizmu bydła. Przemawia za tym masowe występowanie chronicznej postaci tej choroby u bydła w północnej części Niemiec, gdzie znajduje się najwyższa liczba instalacji biogazowych w tym kraju (4, 5). Dodatkowym potwierdzeniem tej hipotezy jest stwierdzana liczba przetrwalników Clostridium spp. w osadach pofermentacyjnych, która waha sięod 104 do nawet 106 w gramie. Istnienie w wewnętrznych warstwach zakiszanej masy warunków beztlenowych, a także pH powyżej 4,6, sprzyja rozwojowi spor C. botulinum do form wegetatywnych i produkcji toksyny (2).

Wykrywanie C. botulinum jest zadaniem skomplikowanym. Istnienie w obrębie rodzaju Clostridium szczepów o podobnych fenotypie do C. botulinum uniemożliwia miarodajną identyfikację biochemiczną tego patogenu. Metodą uznawaną za „złoty standard” w praktyce laboratoryjnej jest test biologiczny na myszach. Obecnie, coraz częściej wykorzystywane są metody wykrywania genów warunkujących toksyczność tego patogenu. Technika łańcuchowej reakcji polimerazy DNA (PCR) umożliwia bezpośredniąi specyficzną detekcję C. botulinum, z pominięciem długotrwałego, pracochłonnego oraz kontrowersyjnego etycznie procesu potwierdzania przynależności podejrzanych szczepów do gatunku (2, 3).

Celem niniejszej pracy było przeprowadzenie badań kiszonek stosowanych w żywieniu bydła, zgromadzonych w latach 2010 – 2014, przy zastosowaniu tradycyjnych metod mikrobiologicznych oraz metod biologii molekularnej opartych na technice PCR, w kierunku wykrywania i określania typów toksycznych C. botulinum.

Badaniom poddano 91 kiszonek dla bydła, w tym 22 sianokiszonki oraz 69 kiszonek z kukurydzy. Osiem próbek pochodziło z przypadków podejrzeń wystąpienia botulizmu u bydła. Wszystkie kiszonki analizowano zgodnie z następującymi etapami:

–   hodowla w bulionie TPGY (Tryptone Peptone Glucose Yeast Extract Broth), w warunkach beztlenowych uzyskiwanych przy zastosowaniu zestawów typu Anaerogen;

–   ekstrakcja DNA z hodowli w bulionie TPGY przy zastosowaniu zestawów firmy A&A Biotechnology;

–   hodowla na pożywkach różnicujących wg Willis – Hobbs, FAA (Fastidious Anaerobe Agar), w warunkach beztlenowych uzyskiwanych przy zastosowaniu zestawów typu Anaerogen;

–   ekstrakcja DNA z izolatów podejrzanych o przynależnośćdo gatunku C. botulinum przy zastosowaniu zestawów firmy A&A Biotechnology;

–   identyfikacji patogenu przy zastosowaniu metod:

  • skriningowej real – time PCR umożliwiającej wykrywanie genu ntnh (niehemaglutyniny) wspólnego dla wszystkich typów toksycznych C. botulinum (3);
  • PCR z detekcjąna żelu agarozowym do wykrywania aktywnych form toksyny botulinowej typów C i D, tj. bont/C, bont/D (3);
  • multiplex PCR z detekcjąna żelu agarozowym do wykrywania aktywnych form toksyny botulinowej typów A, B, E, F tj. bont/A, bont/B, bont/E, bont/F (3);
  • testu seroneutralizacji na myszach do wykrywania toksyn typów C oraz D;
  • biochemicznych testów paskowych API 20A oraz Rapid ID 32A firmy bioMerieux.

 

Zastosowane metody biologii molekularnej poddano uprzedniej walidacji przy wykorzystaniu jako matrycy kiszonek z kukurydzy. Metody te umożliwiały osiągnięcie 100% specyficzności oraz granicy wykrywalności wyrażonej jako LOD50 na poziomie od 0,035 (0,022 – 0,054) spor/g do 0,891 (0,542 – 1,464) spor/g.

Uzyskane wyniki wskazały na obecność C. botulinum typu D w 2 (2,19%) próbkach kiszonek pochodzących z przypadku botulizmu u bydła. Pozytywne rezultaty otrzymano z  odczytów testu PCR oraz seroneutralizacji na myszach. W obu przypadkach nie uzyskano izolatów C. botulinum, lecz szczepy o podobnym fenotypie niewykazujące zdolności do produkcji toksyn botulinowych. Wyniki testu Rapid ID 32A wskazały na profil biochemiczny wspomnianych szczepów, charakterystyczny dla III grupy metabolicznej do której należą C. botulinum i C. novyi. Wyniki analizy biochemicznej przy zastosowaniu testów API 20A uwidoczniły charakterystyczne cechy fenotypowe badanych izolatów dla C. botulinum i C. sporogenes. Uzyskane produkty PCR poddano analizie sekwencji w Zakładzie Mikrobiologii PIWet – PIB. Wyniki sekwencjonowania interpretowane przy zastosowaniu algorytmu BLAST wskazały na 98% homologię z odpowiednimi sekwencjami genu bont/D zdeponowanymi w Bazie GeneBank. W trakcie badań z 11 (12,08%) próbek kiszonek izolowano szczepy o podobnym fenotypie do C. botulinum. Wspomniane izolaty wykazywały w testach biochemicznych cechy charakterystyczne dla C. botulinum, jednak nie posiadały zdolności produkcji toksyn botulinowych.

Zjawisko występowania szczepów o podobnych cechach biochemicznych charakterystycznych dla C. botulinum wskazuje na trudności diagnostyczne botulizmu przy zastosowaniu opisanych technik mikrobiologicznych (3). Wykorzystane metody PCR umożliwiają wykrywanie C. botulinum ze 100% specyficznością, bez konieczności przeprowadzania długotrwałego procesu izolowania i weryfikacji przynależności szczepów o podobnym fenotypie do tego gatunku. Wykrywanie C. botulinum typów C i D jest utrudnione ze względu na możliwość utraty w trakcie procesu izolacji specyficznych bakteriofagów lizogenicznych warunkujących ich toksyczność. Uzyskane rezultaty wskazująna konieczność podjęcia dalszych prac nad udoskonaleniem metod wykrywania C. botulinum i toksyn botulinowych. Przeprowadzone doświadczenia pozwalają również na wniosek, że zastosowanie metod opartych na technice PCR stanowi użyteczne narzędzie w diagnozowaniu botulizmu bydła na tle toksyn produkowanych przez C. botulinum C i D.

Słowa kluczowe: Clostridium botulinum, kiszonki, bydło, PCR, real – time PCR.

Keywords: Clostridium botulinum, silages, cattle, PCR, real – time PCR.