twitter

image1 image1 image1 image1

Identyfikacja BoNT techniką LC-MS-MS/MS z automatyczną analizą danych

Identification of BoNT by LC-MS-MS/MS with automatic data analysis

Elżbieta Kukier, Krzysztof Kwiatek, Tomasz Grenda, Magdalena Goldsztejn, Piotr Jedziniak*

Zakład Higieny Pasz, *Zakład Farmakologii i Toksykologii,

Państwowy Instytut Weterynaryjny – Państwowy Instytut Badawczy

Toksyny botulinowe (BoNTs) są najbardziej toksycznymi substancjami poznanymi dotąd przez człowieka, a zarazem jest to czynnik etiologiczny botulizmu ludzi i zwierząt. Siedem typów toksyny (A-G) może być produkowanych zarówno przez szczepy C. botulinum, jak też C. butyricum, C. baratii czy C. argentinense. Nieleczony botulizm prowadzi do wiotkich porażeń mięśni, a w ciężkich przypadkach do śmierci w wyniku niewydolności mięśni oddechowych. Metodą referencyjną wykrywania BoNTs jest próba biologiczna zatwierdzona przez Association of Official Agricultural Chemists (AOAC), która ma ograniczone zastosowanie w sytuacjach, gdy nie jest możliwa izolacja szczepu bakteryjnego odpowiedzialnego za obecność BoNT w badanej próbce. Dodatkową wadą tej metody jest czasochłonność i konieczność prowadzenia badań na zwierzętach. Opracowane w ostatnim dziesięcioleciu alternatywne metody wykrywania BoNT oparte na reakcjach immunologicznych (np. ELISA) cechuje niska czułość i swoistość, wynikająca z różnic w pierwszorzędowej budowie BoNTs w obrębie każdego toksotypu oraz obecności różnego rodzaju inhibitorów obecnych w żywności, paszach czy w kale. Z kolei, wynik dodatni w polimerazowej reakcji łańcuchowej (PCR), wykorzystanej do wykrywania genów kodujących poszczególne typy BoNT świadczy o obecności poszukiwanego genu C. botulinum, jednak nie jest dowodem obecności BoNT w badanej próbce.

Dynamiczny rozwój proteomiki w ciągu ostatnich lat i białkowa struktura BoNTs jest powodem podejmowania prób detekcji tego białka bakteryjnego techniką chromatografii cieczowej w połączeniu ze spektrometrią mas. Badania prowadzone w Zakładzie Higieny Pasz PIWet-PIB w Puławach potwierdziły możliwość identyfikacji białka BoNT typu A (BoNT/A) w próbce techniką LC-MS-MS/MS z automatyczną analizą danych. Przygotowanie BoNT/A do analizy obejmowało doprowadzenie pH próbki do poziomu optymalnej aktywności trypsyny, a następnie proteolizę w temperaturze 37°C. Następnie aktywność enzymu była blokowana przez obniżenie pH, a próbki były badane techniką LC-MS-MS/MS z automatyczną analizą danych. Analiza sekwencji aminokwasowej specyficznej dla BoNT miała charakter jakościowy i odbywała się w oparciu o generowane przez system bazy danych Mascot listy peptydów i białek zidentyfikowanych dotychczas na świecie.

Słowa kluczowe: toksyny botulinowe, identyfikacja, botulizm. 

Key words: botulinum toxins, identification, botulism.