twitter

image1 image1 image1 image1

Wieloskładnikowa metoda oznaczania tetracyklin i fluorochinolonów w wodzie do pojenia zwierząt

A multi-class method for the determination of tetracyclines and fluoroquinolones in animal drinking water

Ewelina Patyra, Monika Przeniosło-Siwczyńska, Krzysztof Kwiatek

Zakład Higieny Pasz,

Państwowy Instytut Weterynaryjny - Państwowy Instytut Badawczy

Antybiotyki z grupy tetracyklin (TCs) i fluorochinolonów (FQs), takie jak: oksytetracyklina (OTC), tetracyklina (TC), chlorotetracyklina (CTC), doksycyklina (DC), enrofloksacyna (ENR), sarafloksacyna (SAR), ciprofloksacyna (CIP) oraz flumechina (FLU), są jednymi z najczęściej stosownych substancji przeciwbakteryjnych w medycynie weterynaryjnej. Powszechność ich stosowania wynika z szerokiego zakresu przeciwbakteryjnego, jaki wykazują obie grupy antybiotyków. Bakteriostatyczny mechanizm działania tetracyklin polega na hamowaniu biosyntezy białek poprzez blokowanie podjednostki 30S rybosomów bakteryjnych i zaburzeniu procesów energetycznych w komórkach bakteryjnych. TCs wykazują działanie zarówno wobec bakterii Gram-dodatnich jak i Gram-ujemnych oraz drobnoustrojów z rodzaju Rickettsia, Coxiella i Mycoplasma, a także krętków i niektórych bakterii z rodzaju Mycobacterium. Z kolei fluorochinolony wykazują działanie bakteriobójcze. Mechanizm działania tej grupy związków polega z kolei na inhibicji gyrazy DNA. Enzym przy wykorzystaniu energii pochodzącej z ATP rozplata helisę DNA, udostępniając tym samym matrycę dla enzymów replikacji DNA lub transkrypcji, przez co uniemożliwiają odczytanie informacji genetycznej i rozwój komórki bakteryjnej. FQs stosowane są głównie w zakażeniach bakteriami Gram-ujemnymi, działają również na patogenny atypowe, takie jak Chlamydia, Mycoplasma i Legionella. Ze względu na wysoką aktywność przeciwbakteryjną, jaką wykazują obie grupy antybiotyków, znalazły one zastosowanie w leczeniu szeregu jednostek chorobowych takich jak: zakażenia przewodu pokarmowego i dróg oddechowych, w leczeniu zakażeń skórnych i dróg moczowo-płciowych, u takich gatunków jak bydło, świnie, drób, koty i psy.

Przez długi czas substancje przeciwbakteryjne podawane były zwierzętom głównie z paszą w dawkach subterapeutycznych jako tak zwane antybiotykowe stymulatory wzrostu. Od momentu wprowadzenia przez Unię Europejską dnia 1 stycznia 2006 roku całkowitego zakazu stosowania antybiotykowych stymulatorów wzrostu w produkcji zwierzęcej, środki przeciwbakteryjne mogą być podawane w postaci iniekcji, z paszą (w postaci pasz leczniczych) oraz z wodą na zlecenie lekarza weterynarii. TCs i FQs często stosowane są z wodą pitną, szczególnie u drobiu w leczeniu wielu zakażeń bakteryjnych. Podawanie tych leków w celach terapeutycznych z wodą pitną może doprowadzać do występowania ich pozostałości w sieci wodociągowej bądź poidłach, już po zaprzestaniu ich podawania w celach leczniczych. Niskie stężenia tych antybiotyków w wodzie mogą być również wynikiem nielegalnego stosowania dawek subterapeutycznych antybiotyków w celu poprawy dziennych przyrostów masy ciała zwierząt i drobiu rzeźnego oraz ogólnego stanu ich zdrowia. Przyjmowanie niskich dawek leków przeciwbakteryjnych przez zwierzęta przez długi okres czasu może przyczyniać się do nabywania oporności przez drobnoustroje chorobotwórcze, a tym samym uniemożliwić zastosowanie danych grup chemicznych antybiotyków w zwalczaniu wielu chorób. Ponadto substancje przeciwbakteryjne mogą gromadzić się w tkankach jadalnych oraz jajach, a także przyczyniać się do występowania reakcji alergicznych i toksycznych u zwierząt oraz ludzi. W związku z powyższym ważne jest prowadzenie kontroli stosowanych antybiotyków i ich pozostałości w wodzie do pojenia zwierząt w celu ochrony zdrowia zwierząt i konsumentów. Dlatego też laboratoria urzędowe zmuszone są do opracowania czułych i wiarygodnych metod oznaczania pozostałości antybiotyków z grupy tetracyklin i fluorochinolonów w wodzie pitnej dla zwierząt.

Celem niniejszej pracy było opracowanie metody pozwalającej na wykrycie i oznaczenie ilościowe OTC, TC, CTC, DC, SAR, ENR, CIP i FLU w wodzie pitnej dla zwierząt z wykorzystaniem techniki chromatografii cieczowej z detektorem diodowym. Próbki wody dostarczone do badań zakwaszano do pH 3 kwasem ortofosforowym, a następnie odwirowywano celem usunięcia zanieczyszczeń stałych. Kolejno przygotowane próbki wody poddawano zagęszczeniu i oczyszczeniu z zastosowaniem ekstrakcji do fazy stałej (SPE). W tym celu używano kolumienek polimerowych Oasis HLB (Waters USA), które kondycjonowano metanolem i wodą do LC, następnie naniesiono 40 ml próbki wody, przemyto wodą do LC, a antybiotyki eluowano metanolem. Eluat suszono w strumieniu azotu, a osad rozpuszczono w 0,5 ml mieszaniny 0,1% kwasu trifluorooctowego i metanolu. Następnie przygotowane próbki poddano analizie chromatograficznej z wykorzystaniem kolumny firmy Agilent C18 (150 x 4,6 mm, 5 µm). Do detekcji antybiotyków zastosowano detektor z matrycą diodową, długość fali UV dla wszystkich badanych związków ustalono na 330 nm. W celu odpowiedniego rozdziału analizowanych chemioterapeutyków zastosowano elucję gradientową z wykorzystaniem 0,1% kwasu trifluorooctowego, acetonitrylu i metanolu. Średnie odzyski dla badanych antybiotyków wyniosły od 94,6% do 111,8%. Limit decyzyjny (CCa) i zdolność wykrywania (CCb) dla TCs i FQs wyniosły od 9,8 do 26 µg/l od 23,7 do 63,0 µg/l odpowiednio. Opracowana metoda analityczna jest przydatna do rutynowych analiz wykrywania i oznaczania tetracyklin i fluorochinolonów w wodzie do pojenia zwierząt.

Słowa kluczowe: tetracykliny, fluorochinolony, woda, SPE, HPLC-DAD.

Keywords: tetracyclines, fluoroquinolones, water, SPE, HPLC-DAD.