twitter

image1 image1 image1 image1

Ilościowe oznaczanie fluorochinolonów w paszach

Quantitative determination of fluoroquinolones in animal feedingstuffs

Ewelina Patyra, Monika Przeniosło-Siwczyńska, Krzysztof Kwiatek

Państwowy Instytut Weterynaryjny – Państwowy Instytut Badawczy Al. Partyzantów 57, 24 – 100 Puławy

Fluorochinolony, takie jak ciprofloksacyna, enrofloksacyna, sarafloksacyna i flumechina należą do drugiej generacji chinolonów. Stanowią ważną grupę syntetycznych środków przeciwbakteryjnych stosowanych zarówno w medycynie ludzkiej, jak i weterynarii. Fluorochinolony to związki bakteriobójcze, których mechanizm działania polega na inhibicji gyrazy DNA. Enzym ten przy wykorzystaniu energii pochodzącej z ATP rozplata helisę DNA, udostępniając tym samym matrycę dla enzymów replikacji DNA lub transkrypcji, przez co uniemożliwia odczytanie informacji genetycznej i rozwój komórki bakteryjnej. Wymienione fluorochinolony to chemioterapeutyki stężeniozależne, wysoce aktywne wobec tlenowych bakterii Gram-ujemnych, w mniejszym stopniu wobec bakterii tlenowych Gram-dodatnich, natomiast nie działają na bakterie beztlenowe. W medycynie weterynaryjnej stosowane są w leczeniu szeregu jednostek chorobowych u takich gatunków jak drób, świnie, bydło oraz zwierząt towarzyszących (psy, koty).

Przez długi czas substancje przeciwbakteryjne podawane były zwierzętom gospodarskim głównie z paszą w dawkach subterapeutycznych jako tak zwane antybiotykowe stymulatory wzrostu. Od momentu wprowadzenia przez Unię Europejską dnia 1 stycznia 2006 roku całkowitego zakazu stosowania antybiotykowych stymulatorów wzrostu w produkcji zwierzęcej, środki przeciwbakteryjne mogą być podawane na zlecenie lekarza weterynarii w postaci iniekcji, z paszą (w postaci paszy leczniczej) oraz z wodą. Podawanie środków przeciwbakteryjnych w dawkach subterapeutycznych jako nielegalnych stymulatorów wzrostu, bądź nieumyślne wprowadzanie do żywienia zwierząt pasz zanieczyszczonych niskimi stężeniami chemioterapeutyków, może stać się przyczyną nabywania oporności przez drobnoustroje chorobotwórcze, a tym samym uniemożliwić zastosowanie danych grup chemicznych chemioterapeutyków w zwalczaniu wielu jednostek chorobowych. Ponadto substancje przeciwbakteryjne mogą gromadzić się w tkankach jadalnych zwierząt rzeźnych, w jajach oraz w mleku, co może być przyczyną występowania reakcji alergicznych i toksycznych u zwierząt, jak i ludzi. Ponadto tkanki zwierząt rzeźnych,
w których stwierdzono obecność substancji przeciwbakteryjnych przekraczają wyznaczone maksymalne limity pozostałości (MRL), są wycofywane z rynku i nie mogą być dalej wykorzystywane przez ludzi, co przyczynia się do strat ekonomicznych ponoszonych przez nieuczciwych hodowców. W związku z powyższym ważne jest prowadzenie kontroli stosowanych środków przeciwbakteryjnych zarówno w paszach leczniczych, jak i innych rodzajach pasz w celu ochrony zdrowia zwierząt, jak i konsumentów spożywających żywność pochodzenia zwierzęcego. Dlatego też laboratoria urzędowe zmuszone są do opracowania czułych i wiarygodnych metod oznaczania zanieczyszczeń lub nielegalnego dodatku chemioterapeutyków w paszach dla zwierząt.

Pomimo, że substancje przeciwbakteryjne z grupy fluorochinolonów nie są dopuszczone do stosowania w paszach i materiałach paszowych dla zwierząt rzeźnych,  zdarzają się przypadki występowania niskich stężeń tych chemioterapeutyków w mieszankach paszowych. Dlatego też celem pracy było opracowanie metody pozwalającej na wykrycie i oznaczenie ilościowe ciprofloksacyny, enrofloksacyny, sarafloksacyny i flumechiny w paszach dla zwierząt rzeźnych z wykorzystaniem techniki chromatografii cieczowej z detektorem fluorescencyjnym. Próbki pasz dostarczone do badań w pierwszej kolejności mielono, a następnie poddano ekstrakcji mieszaniną 0,1M kwasu chlorowodorowego i acetonitrylu. Tak przygotowane próbki odwirowano, a uzyskany ekstrakt rozcieńczono w 0,01M kwasie szczawiowym o pH 4 w proporcji 2:8 v/v, wymieszano i ponownie odwirowano. W kolejnym etapie otrzymany ekstrakt oczyszczono z zastosowaniem ekstrakcji do fazy stałej (SPE) z wykorzystaniem kolumienek polimerycznych Strata-X (Phenomenex, USA), które kondycjonowano 3 ml metanolu, 3 ml wody do LC, następnie naniesiono 6 ml próbki, przemyto 6 ml wody do LC, a chemioterapeutyki eluowano 3 ml 0,1% kwasu mrówkowego w acetonitrylu. Eluat wysuszono w strumieniu azotu, a pozostały osad rozpuszczono w 1 ml 0,01M kwasu szczawiowego o pH 4. Następnie przygotowane próbki poddano analizie chromatograficznej, z wykorzystaniem kolumny Kinetex C18 firmy Phenomenex. Do detekcji fluorochinolonów zastosowano detektor fluorescencyjny. W celu odpowiedniego rozdziału analizowanych związków zastosowano elucję gradientową z wykorzystaniem 0,025M kwasu ortofosforowego i 0,025M 1-haptanosulfonianu sodu w wodzie do LC i acetontrylu. Średnie odzyski dla badanych substancji przeciwbakteryjnych wyniosły od 99,1% do 99,3%. Limit decyzyjny (CCa) i zdolność wykrywania (CCb) dla czterech badanych fluorochinolonów wyniosły od 229 do 301µg/kg. Opracowana metoda analityczna jest przydatna do rutynowych analiz wykrywania i oznaczania fluorochinolonów w paszach.

Słowa klucze: fluorochinolony, pasza, SPE, HPLC-FLD.

Keywords: fluoroquinolones, animal feedingstuffs, SPE, HPLC-FLD.