twitter

image1 image1 image1 image1

Białka C. botulinum i toksyny botulinowej w materiale biologicznym – nowe markery botulizmu

C. botulinum and botulinum toxin proteins in biological material - new markers of botulism

Elżbieta Kukier, *Janusz Dębski, Tomasz Grenda, Magdalena Goldsztejn, Krzysztof Kwiatek

Zakład Higieny Pasz, Państwowy Instytut Weterynaryjny – Państwowy Instytut Badawczy,

Al. Partyzantów 57, 24-100 Puławy,

*Środowiskowe Laboratorium Spektrometrii Mas, Instytut Biochemii i Biofizyki PAN,

ul. Pawińskiego 5A, 02-106 Warszawa

 

Neurotoksyny botulinowe (BoNTs) są najbardziej toksycznymi substancjami biologicznymi poznanymi dotychczas, a ich dawka śmiertelna dla człowieka wynosi około 1 ng/kg masy ciała. BoNTs wywołują botulizm ludzi i zwierząt, a choroba przebiega z objawami wiotkiego paraliżu mięśni szkieletowych, spowodowanego blokowaniem przewodnictwa nerwowo-mięśniowego. W Polsce rejestruje się rocznie kilkadziesiąt przypadków botulizmu ludzi i około dwudziestu ognisk botulizmu zwierząt. Zachorowania najczęściej występują u bydła karmionego kiszonkami zanieczyszczonymi przez BoNT, rzadziej u koni (sianokiszonka), dzikiego ptactwa wodnego (żerowanie na terenach zalewowych z rozkładającymi się szczątkami zwierząt) czy zwierząt futerkowych. Jedyną metodą wykrywania BoNTs zatwierdzoną obecnie przez AOAC jest próba biologiczna na myszach (mouse bioassay, MBA). Metoda ta ma jednak ograniczone zastosowanie gdy objawy botulizmu są wyraźnie wyrażone co oznacza, że większość BoNT jest związana w zakończeniach nerwowo-mięśniowych i niewiele pozostaje jej we krwi. Ponadto, pomimo relatywnie wysokiej czułości, MBA rzadko jest użyteczna do diagnostyki botulizmu koni, które są od 1 000 do 10 000 razy bardziej wrażliwe na BoNT niż myszy. Największym osiągnięciem ostatniej dekady w wykrywaniu BoNTs było zastosowanie techniki LC-MS/MS. Białkiem docelowym tych metod jest strawiona BoNT lub pocięte przez nią białka kompleksu SNARE, odpowiadające za uwolnienie acetylocholiny i skurcz mięśni. Badania przeprowadzone w Zakładzie Higieny Pasz PIWet-PIB w Puławach potwierdziły możliwość detekcji i identyfikacji białek BoNT oraz białek komórkowych C. botulinum techniką LC-MS/MS. Automatyczna analiza danych zidentyfikowała docelowe peptydy na podstawie ich specyficznej sekwencji aminokwasowej. Zaletą opracowanej metody, w porównaniu do innych metod opartych o tę technikę, jest proste i szybkie przygotowanie różnego rodzaju próbek biologicznych (surowica, osocze, ekstrakt z żywności/paszy/treści przewodu pokarmowego) do analizy instrumentalnej. Przygotowanie próbki obejmowało jedynie doprowadzenie pH próbki do wartości 7 - 8 (optymalna aktywność enzymu) i trawienie trypsyną przez 16 godzin w 37°C. Uzyskane mieszaniny peptydów były rozdzielane w układzie nano-HPLC (wykorzystujące kolumnę analityczną nanoACQUITY BECH C18), używając jako fazy ruchomej gradientu acetonitrylu 5 - 35%, przez 180 minut w obecności 0,05% kwasu mrówkowego o przepływie 150 nl/minutę. Wylot kolumny chromatograficznej był bezpośrednio sprzężony ze spektrometrem mas Orbitrap Velos (Thermo Electron Corporation, San Jose, CA, USA), na którym wykonywany był pomiar mas peptydów i ich fragmentów. Białka były identyfikowane poprzez porównania uzyskanych mas peptydów i ich fragmentów z bazą danych sekwencji białkowych National Center for Biotechnology Information (NCBI) przy pomocy programu MASCOT (Matrix Science, London, UK). Następnie przeprowadzana była analiza statystyczna wiarygodności uzyskanych przypisań i ustalana lista białek obecnych w próbce. Tolerancja masy jonów mieściła się w granicach 20 ppm i 0,6 Da. Białko uznano za prawidłowo zidentyfikowane, jeżeli prawdopodobieństwo przypadkowego przyporządkowania było mniejsze niż 5%.

Obecność BoNTs została potwierdzona dotychczas tą metodą w wysoko oczyszczonej BoNT/A, płynie hodowlanym wzorcowego szczepu C. botulinum typu A (NCTC 887), surowicy bydlęcej fortyfikowanej oczyszczoną BoNT/A i surowicy ludzkiej od pacjenta z objawami botulizmu (BoNT/E), w której wykazano wcześniej obecność BoNT testem MBA. Wyniki badań umożliwiły również detekcję białek komórkowych C. botulinum w surowicy ludzkiej, bydlęcej i końskiej pochodzących z przypadków podejrzenia botulizmu, co sugeruje obecność BoNT w organizmie i może stanowić nowy marker tej choroby. Oceniając przydatność metody w diagnostyce botulizmu zwierząt, niezwykle interesujące wydają się wyniki badań surowicy i osocza koni podejrzanych o botulizm. O ile analiza instrumentalna nie wykazała obecności BoNT, to wykazano w próbkach obecność białek bakteriofagów warunkujących toksyczność zwierzęcych szczepów C. botulinum C i D, co jest dowodem obecności toksycznych beztlenowców w organizmie zwierząt. Analiza spektrometryczna wykazała również obecność w surowicy obydwu koni białka bakteriofaga charakterystycznego dla C. botulinum typu C, identyfikując jednocześnie serowar BoNT, czego nie udało się określić metodą MBA. Ponadto, różnica wartości Mascot Score (wskaźnik wiarygodności wyniku, pośrednio informuje o ilości białka w próbce) uzyskana dla białek bakteriofaga w surowicach poszczególnych koni, koreluje z nasileniem objawów botulizmu u tych zwierząt, co sugeruje zastosowanie tej metody do ilościowego oznaczania markerów botulizmu w przyszłości.

Biorąc pod uwagę czułość stosowanej metody w połączeniu z wysoce specyficzną automatyczną analizą danych w oparciu o bazę danych sekwencji białkowych NCBI, a także prostym i szybkim przygotowaniem materiału biologicznego do analizy instrumentalnej, jest duże prawdopodobieństwo, że metoda znajdzie szerokie zastosowanie praktyczne w przyszłości.

 

Słowa kluczowe: neurotoksyny botulinowe, C. botulinum, białko, spektrometria mass.

Key words: botulinum neurotoxins, C. botulinum, protein, mass spectrometry.