twitter

image1 image1 image1 image1

Wykrywanie Clostridium botulinum w paszach - trudności analityczne

Tomasz Grenda, Magdalena Grabczak, Elżbieta Kukier, Magdalena Goldsztejn, Krzysztof Kwiatek

Państwowy Instytut Weterynaryjny – Państwowy Instytut Badawczy w Puławach

24-100 Puławy, al. Partyzantów 57

s. 69-79

Streszczenie. Gatunek Clostridium botulinum stanowią laseczki przetrwalnikujące, które zdolne są do produkcji najsilniejszych toksyn biologicznych naturalnie występujących w przyrodzie. Rozróżnianych jest siedem typów toksycznych tego patogenu oznaczanych kolejno od A do G. Celem niniejszej pracy była optymalizacja oraz walidacja „In-house” metody real-time PCR do bezpośredniego wykrywania C. botulinum w próbkach pasz. Do analiz kontaminowanych próbek pasz wykorzystano metodę real-time PCR umożliwiającą amplifikację fragmentu genu ntnh wspólnego dla wszystkich typów toksycznych tego patogenu. W ramach walidacji wyznaczono parametry charakteryzujące metodę ilościową tj: liniowość, współczynnik korelacji, współczynnik zmienności oraz granice wykrywalności. Wartości tych parametrów oszacowano wg wytycznych podanych w normie PN – EN – ISO – 16140. Na podstawie współczynnika kierunkowego krzywych liniowości wyznaczono także wydajności real – time PCR.  Uzyskane wydajności real-time PCR wahały się w granicach 61 – 77%. Wartości te wskazywały na inhibicję reakcji. Granice wykrywalności kształtowały się w zakresie od 114240 – 419822 fg. Niektóre składniki pasz i żywności tj. tłuszcze, wysokocząsteczkowe związki białkowe, immunoglobuliny, a także naturalna mikroflora próbek mogą powodować inhibicję PCR. Pomimo wspomnianych ograniczeń przedstawiona metoda pozwala na specyficzne wykrywanie C. botulinum w próbkach pasz już na poziomie hodowli płynnej, co jest utrudnione w przypadku zastosowania metod immunologicznych.

Słowa kluczowe: Clostridium botulinum, pasze, real-time PCR.

 

Detection of Clostridium botulinum in feeds – analytical difficulties

Tomasz Grenda, Magdalena Grabczak, Elżbieta Kukier, Magdalena Goldsztejn, Krzysztof Kwiatek

Department of Hygiene of Animal Feedingstuffs,  National Veterinary Research Institute,

24-100 Pulawy, Poland

Summary. The bacteria from Clostridium botulinum species are spore-forming rods able to produce the most potent toxins in environment. Within this species seven toxin types are differentiated marked by the letter from A to G. The aim of this study was optimization and In-house validation of real-time PCR method for direct detection of C. botulinum in feed samples. The analyses of contaminated feeds samples were carried out with using of real-time PCR method which enables amplification of ntnh gene fragment common in all C. botulinum toxin types. The characteristic parameters for quantitative method were estimated such as: linearity, correlation factor, variability factor and limits of detection. The mentioned values were calculated according to the PN-EN-ISO-16140 Standard. Efficiency of real-time PCR were estimated on the base of slopes of linearity curves. The obtained results indicated on PCR inhibition. Some feed and food ingredients such as: fats, high molecular proteins, immunoglobulins and natural microflora of samples could couse PCR inhibition. Despite mentioned limitations the presented method enables specific C. botulinum detection in feeds samples even on the step of liquid culture, which is hardly possible in the case of immunological methods.

Keywords: Clostridium botulinum, feeds, real-time PCR.

 

Literatura

Anon.: Mikrobiologia żywności i pasz – protokół walidacji metod alternatywnych. PN-EN ISO 16140:2004.

Anon.: Pasze. Wymagania i badania mikrobiologiczne. PN – R – 64791:1994.

Fach P., Micheau P., Mazuet C., Perelle S., Popoff M. Development of real-time PCR tests for detecting botulinum neurotoxins A, B, E, F producing Clostridium botulinum, Clostridium baratii and Clostridium butyricum 2009, 107, 465-73.

Lindström M., Korkeala H.: Laboratory diagnostics of botulism. Clin Microbiol Rev 2006, 19, 298–314.

Raphael B. H., Anreadis J. D.: Real-time PCR detection of the nontoxic nonhemagglutinin gene as a rapid screening method for bacterial isolates harboring the botulinum neurotoxin (A–G) gene complex. J Microbiol Method 2007, 71, 343–346.

Saeed E. M. A.: Studies on Isolation and Identification of Clostridium botulinum Investigating Field Samples Specially from Equine Grass Sickness Cases. Doctoral dissertation, Faculty of Agriculture, Goettingen, Goettingen University, 2004.

Satterfield B. A., Stewart A. F., Lew C. S., Pickett D. O., Cohen  M. N., Moore E. A., Luedtke P. F., O’Neill K. L., Robison R. A.: A quadraplexed real-time PCR assay for rapid detection and differentiation of the Clostridium botulinum toxin genes A, B, E and F. J Med Microbiol. 2010, 59, 55.

Vu T. L. A.: Incidence of Clostridium botulinum Spores in Honey and Infant Food Samples Collected from Vietnam and Germany. Doctoral dissertation, Faculty of Agriculture, Goettingen University, 2006.

Yoon S., Chung G. T., Kang D., Ryu C., Yoo C.,  Seong W.: Application of real-time PCR for quantitative detection of Clostridium botulinum type A toxin gene in food. Microbiol. Immunol. 2005, 49, 505–511.