twitter

image1 image1 image1 image1

Występowanie modyfikowanych mykotoksyn w paszach dla zwierząt - badania wstępne

Occurrence of modified mycotoxins in animal feeds – preliminary study

s. 34 - 35

Ł. Panasiuk, P. Jedziniak,

Zakład Farmakologii i Toksykologii Państwowy Instytut Weterynaryjny-Państwowy Instytut Badawczy

Słowa kluczowe: mykotoksyny, modyfikowane mykotoksyny, LC-MS/MS

Key words: mycotoxins, modified mycotoxins, LC-MS/MS

Mykotoksyny są to drugorzędowe metabolity, wytwarzane powszechnie w specyficznych warunkach przez pleśnie, należące do rodzaju Aspergillus, Penicillium, Fusarium bądź Alternaria, zdolne do rozwoju na produktach pochodzenia roślinnego. Toksyny te mogą być produkowane w trakcie wzrostu zbóż lub materiałów paszowych na polu, bądź w trakcie ich przechowywania. Spośród setek znanych toksyn największe znaczenie w toksykologii weterynaryjnej mają: aflatoksyna B1, ochratoksyna A, deoksyniwalenol (DON), toksyna T-2 i HT-2, fumonizyny B1 i B2 oraz zearalenon. Po spożyciu paszy skontaminowanej mykotoksynami przez zwierzęta ich obecność może wywoływać zespół objawów zwanych mykotoksykozami. W zależności od ilości skonsumowanej paszy czy gatunku zwierząt, mogą być obserwowane zróżnicowane objawy: od wymiotów i utraty masy przez problemy z rozrodem, aż po powstawanie nowotworów1.

W ostatnich latach zwraca się uwagę na fakt, że stwierdzane poziomy mykotoksyn w paszach mogą być niedoszacowane, na skutek obecności tzw. modyfikowanych form mykotoksyn2. Modyfikowane mykotoksyny mogą być produkowane zarówno przez grzyby i bakterie poprzez biotransformację macierzystej toksyny (np. 3-, 15-acetyl-DON; 3-AcDON, 15-AcDON). W piśmiennictwie można spotkać także termin „maskowane mykotoksyny”, który odnosi się do węższej grupy toksyn powstających w wyniku działania systemu obronnego roślin, gdzie poprzez dołączenie cząstki polarnej do macierzystej mykotoksyny np. glukozy zmniejszają jej toksyczność i ułatwiają usuniecie z komórki (DON-3-glukozyd; DON-3Glc). Obecność maskowanych mykotoksyn może mieć istotne znaczenie toksykologiczne, ponieważ mogą uwalniać się do form macierzystych w przewodzie pokarmowym zwierząt poprzez hydrolizę enzymatyczną. Modyfikowane mykotoksyny są niewykrywalne podczas monitoringowych badań pasz, dlatego kluczowe jest opracowywanie wieloskładnikowych metod, dzięki którym możliwe będzie jednoczesne oznaczanie form podstawowych mykotoksyn jak i pochodnych.

Celem podjętych badań było opracowanie wielkoskładnikowej metody analitycznej oznaczania DON-u i jego metabolitów (DON-3Glc, 3-AcDON, 15-AcDON) w paszach przy użyciu chromatografii cieczowej ze spektrometrią mas (LC-MS/MS), a także weryfikacja jej na próbkach pasz zanieczyszczonych DON-em. Analiza LC-MS/MS została przeprowadzona przy użyciu chromatografu cieczowego Nexera X2 UHPLC sprzężonego z tandemowym spektrometrem masowym LCMS-8050 (Shimadzu). Rozdział chromatograficzny został dokonany za pomocą elucji gradientowej w czasie 12 min, wykorzystując kolumnę LUNA POLAR C18 100x2,1 mm; 1,6µm (Phenomenex). Faza ruchoma składała się 0,2% kwasu octowego oraz acetonitrylu. Temperatura pieca wynosiła 45°C. Procedura przygotowania próbki wyglądała następująco: 1g paszy ekstrahowano 8 ml wody przez 30 min na wytrząsarce horyzontalnej. Następnie próbkę wirowano i oczyszczano przy pomocy kolumienek MycoSep® 225 Trich (ROMER LABS). Kolejno pobrano 2 ml oczyszczonego ekstraktu, dodano 10 µl standardów wewnętrznych (IS) DON i DON-3Glc, a następnie odparowano do suchej pozostałości pod delikatnym strumieniem azotu (40ºC). Całość rozpuszczono w 200 µl fazy wodnej i poddano analizie LC-MS/MS.

Metoda została poddana walidacji zgodnie z wymaganiami dla metod oznaczania mykotoksyn w paszach. Granica wykrywalności (LOD) oraz oznaczalności (LOQ) dla 4 analitów mieściła się w zakresie odpowiednio 1-3 µg/kg oraz 3-10 µg/kg. Krzywa kalibracyjna była liniowa dla wszystkich analitów (R2=0,99), precyzja określona jako odtwarzalność (RSD %) była zadowalająca, poniżej 30%. Uzyskane odzyski dla DON, DON-3Glc, 3-AcDON i 15-AcDON wyniosły odpowiednio 86%, 23%, 84%, 94%. Efekt matrycy (ME) mieścił się w zakresie od 61% do 128%.

Opracowana metoda została wykorzystana do przebadania 40 próbek pasz. DON był oznaczony we wszystkich przebadanych próbkach, zaś DON-3Glc w ponad 90% próbek. Najwyższe odnotowane stężenia dla DON i DON-3Glc wynosiły odpowiednio 1325 µg/kg oraz 364 µg/kg. Co więcej stosunek DON-3Glc do macierzystej toksyny wynosi około 25%. Acetylowane formy DON, były oznaczane w śladowych ilościach. Otrzymane wyniki potwierdzają, że DON-3Glc występuje w paszach równie często jak DON. Stosunkowo wysokie stężenia DON-3Glc świadczą o tym, że wyniki analiz DON w paszach mogą być niedoszacowane. Wyniki potwierdzają, że konieczny jest monitoring pasz pod kątem DON jak również jego metabolitów.

 

  1. Bhat R., Rai R. V., Karim A. A.: Mycotoxins in food and feed: present status and future concerns. Compr. Rev. Food Sci. Food Safety 2010, 9, 57–81.
  2.  Berthiller F., Crews C., Dall´Asta C., Saeger S. D., Haesaert G., Karlovsky P., Oswald I. P., Seefelder W., Speijers G., Stroka J.: Masked mycotoxins: A review, Mol. Nutr. Food Res. 2013, 57, 165–186